ART(人类辅助生殖技术) 巨大的进步并非一蹴而就，而是逐建立和发展起来的
1、超促排卵技术的发展
世界首例试管儿采用的是腹腔镜下自然周期取卵，但绝大部女性自然周期中仅有一个卵子成熟，且排卵时不固定，导致丢卵率很高，很大程度上限制了IVF-ET的成功。如何在一个周期中得到多个成熟卵子成为提高IVF-ET成功率的关键所在。促性腺激素(gonadotropin，Gn)在卵泡发育的启动、选择、优势化和排卵中发挥重要作用。在早卵泡泡期使用外源性Gn能增加卵泡募集的数量，使获得多个卵子成为可能。但仅仅使用Gn促排卵有20%左右的患者出现早发性LH峰(premature LH surge)，卵泡过早黄素化，周期取消率增加。 GnRH激动剂(GnRHagonist，GnRH-a)是20世纪 80 年代人工合成的GnRH类似物。持续使用GnRH-a 可耗竭垂体Gn，降低垂体的敏感性，连续使用10~14天即可达到降调节的目的。在此基础上再联合使用Gn促排卵，既可使多卵泡同步发育，又可抑制早发性 LH 峰，显著提高了 IVF-ET 成功率。近年来临床开始应用GnRH拮抗剂(GnRH-A)，GnRH-A可竞争性结合垂体的GnRH受体，效应产生迅速，去垂体效应及安全性与激动剂无明显差别。拮抗剂方案使用灵活、简单，现已广泛应用于促排卵过程。目前临床常用的超促排卵方案有长方案、短方案、拮抗剂方案、超长方案、超短方案、微刺激方案等。以上方法被称为控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)，COH的应用使 IVF-ET 的成功率显著提高。临床上可根据患者情况选择个体化促排卵方案，以达到最佳的促排卵效果。
2、IVF-ET
俗称“第一代试管婴儿”，以1978 年Louise Brown的出生为标志。IVF-ET 主要适用于输卵管阻塞、男方少弱精、子宫内膜异位症、免疫因素以及不明原因引起的不孕。
主要步骤包括:①早卵泡期使用Gn促进多个卵泡同时发育。通过B超监测卵泡发育情况，结合内分泌激素测定，调整 Gn的用量和时间。当1个卵泡直径达到20mm或3个卵泡直径达到18mm，便可注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)促使卵泡最终成熟。
②在注射hCG后36 小时即可取卵。目前多采用B超引导下经阴道以细针穿刺成熟卵泡，抽吸出卵泡液后找出卵丘卵母细胞复合物。
③取出的卵母细胞在培养液中培养数小时，使其进一步成熟，将实验室处理后获得受精能力的精子按一定浓度加人含卵子的培养液中使之受精。
④当受精卵发育至4~8个细胞或者囊胚时，用胚胎移植管将胚胎注入宫腔内;
⑤胚胎移植后通常给予黄体酮行黄体支持以提高临床妊娠率。移植后 14 天测定血 hCG 确定是否妊娠。当妊娠维持至分娩时IVF ET才真正成功。
3、ICSI技术
1988年Gordongn和Talansky首次报道利用生化方法在卵子透明带上打孔使精子进人卵膜受精，后来Cohen 在显微镜下采用部分透明带切除(partial zona dissection，PZD)解决有些患者精子无法受精的问题，但形成的受精卵数目有限。后来出现了透明带下授精术(subzonal insemination，SUZI)，即将单个或多个精子直接注射到透明带下卵细胞外的周围间隙使之受精。1992年比利时自由大学的Palermo在进行SUZI时不小心把一个精子注入了卵浆内，后来卵子受精了，并且正常卵裂。他们得到了启发，由此建立了ICSI技术。
ICSI技术，又称“第二代试管婴儿”，是借助显微操作系统将单个精子注入卵母细胞质中，从而达到授精的目的。该技术的建立是 ART 领域又一重大进展，特别是对男性不育的治疗更具有重要的意义。ICSI主要用于治疗严重男性不育症，适用于IVF 难以治疗的重度/极重度少弱畸精症、逆行射精症、梗阻性无精子症以及 IVF 受精失败的患者。1992 年，世界上首例应用ICSI技术成功妊娠并分娩的婴儿在比利时诞生。1996年10月3日，我国首例ICSI试管婴儿在广州中山大学附属第一医院生殖医学中心诞生。ICSI技术的应用拓展了男性不育治疗的范围，使以往认为绝对性不育的男性患者有了生育自己子代的可能。
ICSI 技术的安全性受到广泛关注，因为ICSI把在自然情况下难以受精的精子直接注入卵细胞内，逃避了自然选择的过程，使原本不能受精的精子有可能将遗传缺陷传给下一代。有研究表明，Y染色体长臂基因或基因簇微缺失与无精或严重少弱精有关。严重少、弱精子症患者染色体异常(包括嵌合体)比例较正常人群高。此外， ICSI过程中对卵子的操作可能会对卵子造成一定程度损害。2002 年，Michele Hansen等人的研究表明ICSI技术出生婴儿患畸形的风险与IVF技术相似。2007 年，Satker 认为ICSI 本身并不是独立危险因素，父母双方本身的缺陷增加先天性畸形率。从安全性的角度出发，把握好 ICSI的适应证并加强安全性方面的基础研究和流行病学调查是必要的。
4、PGD和胚胎植入前遗传学筛查
PGD是指对移植前的胚胎进行染色体数目、结构或者是否携带某种特定致病基因进行遗传学检测，以选择无遗传学疾病的胚胎植入宫腔，从而获得正常胎儿的技术。胚胎植人前遗传学筛查(preimplantation genetic screening，PGS)是对移植前胚胎进行遗传学筛查，筛查内容不局限于某种特定致病遗传因素，以挑选遗传学正常的胚胎植入宫腔，提高试管婴儿的整体成功率。虽然PGD 和 PGS 在目标人群和检测内容上有所差别，但随着检测技术的发展，两者在技术层面逐渐趋于相同。
PGD/PGS 技术做为IVF重要的衍生技术之一，也被称为“第三代试管婴儿”，该技术的应用对于阻断遗传性疾病的传递，提高出生人口质量具有重要意义。
1990年，世界上首例 PGD由Handyside团队完成，其治疗对象为两对携带 X连锁隐性遗传病的大妇。研究人员通过扩增 Y染色体特异性重复序列对胚胎上分离的单细胞进行性别鉴定，挑选女性胚胎进行移植，最终成功分娩健康双胎女婴。
2000年4月，我国第一例通过 PGD 技术的健康试管婴儿在中山大学附属第一医院妊娠分娩。
虽然 PGD 技术出现较早，但由于当时IVF- ET整体成功率低，特别是检测方法效率低下， PGD 技术的发展和应用一度受到很大的限制。20世纪 90年代末到本世纪初，人类基因组学领域的发展突飞猛进，取得了很多重要成果，这些成果的取得为 PGD/PGS 技术的快速发展和临床应用打开了崭新的局面。基因检测方法从最初的荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization FISH)、比较基因组杂交(comparative genomic hybridization，CGH)到基于芯片的比较基因组杂交(ArrayCCH)、单核苷酸多态性芯片(single nucleotide polymorphisms array，SNP Array)以及实时定量 PCR，这些基因检测技术的应用极大地提高了 PGD/PGS 的准确率和效率，为 PGD/PGS的应用和推广提供了有力的技术支持。随着新一代高通量测序技术--下-代测序技术(next generation sequencing，NGS)的发展，测序时间和成本快速下降，再加上测序作为基因检测金标准的这一内在特点，NGS已成为PGD/PGS的重要支撑技术。未来，全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)的发展有可能为 PGD/PGS 提供完美的解决方案。
5、胚胎、配子及性腺组织冻融技术的发展
随着冻融技术的发展，长期保存生殖细胞、胚胎和生殖组织成为可能。1984年Zeilmaker 首次报道人类冻融胚胎婴儿的出生。我国首例冻存胚胎试管婴儿于1995年在北京大学第三医院诞生2004年意大利诞生了世界首例“三冻”(冻卵冻精、冻胚胎)试管婴儿，2006年我国首例“三冻”试管婴儿在北京大学第三医院诞生。
胚胎冷冻技术已成为ART的常规技术之一，将剩余胚胎冷冻可提高每个取卵周期的累计妊娠率，避免胚胎浪费和再次超促排卵。另外，对卵巢过度刺激高风险的患者实施全胚冷冻可避免发生严重的卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)。胚胎冷冻以往多采取程序化冷冻，但解冻后妊娠率不理想。玻璃化冷冻保存技术作为近几年来使用的一项新技术，因其简单、高效的特点，受到越来越多的关注，临床使用也越来越广泛。玻璃化冷冻法是将细胞在较短的时间内固化成全玻璃态的一一种保存方法，让细胞保持其溶液状态的分子和离子分布，避免在细胞内形成冰晶，减少细胞内结构的损伤，从而提高胚胎复苏率及着床率。随着玻璃化冷冻的广泛应用，该冷冻方法有取代程序冷冻法的趋势。
配子冷冻技术包括精子和卵子冷冻。精子冷冻早在1953年即开始成功应用于人工授精，但研究者仍在不断优化精液冻存的方法。最近的研究发现使用微管进行玻璃化冷冻精子是一种安全而又具有优势的方法。精子冷冻术不仅使精子库的建立成为可能，还能为年轻的男性恶性肿瘤患者保存自己的生育能力。与精子、胚胎冷冻技术相比，卵母细胞冻存技术进展较缓慢。虽然卵子冻融存活率可达 80%，但受精后的胚胎着床率与妊娠率低。卵子玻璃化冻存技术仍面临诸多问题如卵子 DNA 碎片、冷冻导致低水平谷胱甘肽等增加卵子对氧的胁迫敏感性，降低受精率与继续发育潜能。目前卵子库的建立尚有待于卵子冷冻技术的进一步突破。
恶性肿瘤诊治技术的发展使年轻女性肿瘤患者的长期生存率得到明显改善，但大剂量联合化疗和放疗对性腺的损伤是不可逆的，甚至会使她们完全失去生育能力。如何保留这些年轻女性恶性肿瘤患者的生育能力是生殖医学领域面临的新课题，而卵巢组织冷冻也成为近年来生殖医学工程的研究热点。卵巢组织深低温保存具有不需要超促排卵治疗，不影响恶性肿瘤患者的治疗，不受年龄及婚姻状况的限制等优点。卵巢组织冷冻采取的方法主要为程序化慢速冷冻和玻璃化冷冻两种方法。近年来，玻璃化冷冻法有取代程序化冷冻的趋势，但总的来说，卵巢组织冷冻保存研究尚处于起步阶段。
6、未成熟卵母细胞体外成熟技术
未成熟卵母细胞体外成熟技术(in vitro maturation， IVM)是指在不经过超促排卵或应用少量Gn后从卵巢中获取未成熟的卵母细胞，在体外适宜的条件下进行培养，使卵母细胞成熟并具备受精能力。1991年Cha等成功获得世界第一例IVM妊娠并分娩的婴儿。1994 年 Allen Tounson 用非刺激周期为PCOS妇女获得不成熟卵子IVM并成功获得妊娠。自第一例IVM成功以来，IVM技术在实验室和临床方面都取得了较大的进展。作为一种新兴的辅助生殖技术，IVM 可应用于多囊卵巢综合征等疾病的助孕过程中，并能够获得较高的临床妊娠率。同时，IVM 也为卵巢组织冷冻保存后卵母细胞成熟问题以及未成熟卵母细胞冷冻保存后的应用问题提供了解决方案。目前全世界已有超过400个IVM婴儿出生，但大部分未作染色体核型分析等相关检查，因此就其安全而言，仍需要长期随访研究。
7、卵细胞质置换技术
又称“第四代试管婴儿”，是通过显微技术方法将年轻健康女性的卵子内细胞质移植到活力较差的卵子内，以改善卵子质量，提高试管婴儿成功率。1998年， Cohen 通过该技术成功获得第一例第四代试管婴儿。我国第一例第四代试管婴儿于 2004 年在武汉大学人民医院诞生。卵细胞质置换技术主要用于年龄较大，卵巢功能衰退的女性，以及线粒体遗传病等。但由于供卵者卵细胞质中线粒体 DNA会被带入受体卵细胞，涉及伦理和法律等问题，目前我国和世界上大多数国家尚未允许该技术的临床应用。
ART作为一项新技术，其发展轨迹离不开新生事物的发展规律，即萌芽状态、快速推广和有序发展三个阶段。我国的 ART 技术在经历了艰难起步之后已取得长足的进步，进入有序发展的阶段。目前，我国的 ART 技术在各个方面正与国际水平接轨，在一些领域已经达到国际先进水平。
引用文献：黄荷凤 院士 《实用人类辅助生殖技术》
