哺乳动物受精是一个多步骤的复杂过程,精子需要穿过卵丘细胞和透明带,最后再通过与卵子表面特异性的分子识别后才完成融合过程并形成受精卵,这个过程是由一系列精子与卵子质膜的相互作用而触发的,这些相互作用的基本过程包括:卵(reconition)精卵结合(binding)和精卵质膜融合(fusion)。精子和卵子的识别包括两步:精子附着在卵子表面称为附着;精子和卵子的透明带结合称为结合。
1.透明带蛋白
透明带(zona pellucida,ZP是包绕卵细胞周围的膜状保护层,其成分为糖蛋白,由卵细胞和颗粒细胞分泌。ZP在受精(精卵结合、阻止多精受精)和胚胎着床前的早期发育中发挥重要作用。人类ZP是由4种糖蛋白(ZP1-4)组成的一层包绕卵母细胞、平均厚度17um的外壳,由卵母细胞和颗粒细胞分泌到卵周间隙所形成,通过可见光显微镜观察到,正常的透明带形态为半透明的膜状物。通过扫描电子显微镜观察到,透明带具有多孔网状结构和(或)近光滑的紧凑模式。通过更高分辨率的扫描电子显微镜观察,透明带呈一个薄的互相交连的细丝状结构,在宽广和紧密的网格表面呈现出规律的交叉图形
人类ZP2、3、4聚合成三个单层膜,并由 ZPI连接在一起形成完整的透明带。透明带是一个动态形成的膜状结构,在排卵前2周的时间里卵母细胞和颗粒细胞开始大量地特异性表达ZPI-4,在内质网上合成ZP、N-和O-低聚糖糖化通过高尔基体新生成的透明带糖蛋白被纳人大量分泌囊泡,独自转移至卵母细胞质膜,并组装成交联的细丝状,融入到增厚 ZP 的最里层
ZP包绕哺乳动物卵母细胞、排出的卵子直到囊胚阶段的胚胎,在卵子发生、受精和胚胎着床前的发育中起着至关重要的作用:
①负责在卵母细胞的早期阶段保持完整性;
②精卵结合时特异性识别;
③诱导精子产生胞吐作用发生顶体反应,并防止多精受精;
④在植入前,保证胚胎的完整性,防止卵裂球分散和增强彼此间的互动。
透明带蛋白的结构具有几个共同的特征:透明带结构域、跨膜结构域、弗林蛋白酶裂解位点和C-端细胞质尾、N-端信号序列。ZP1和 ZP4的三叶草结构域包含大量半胱氨酸残基,具有结构的保守性。透明带结构域则是一种蛋白聚合模块,在许多真核细胞蛋白质中都发现了它的存在,在透明带蛋白聚合或形成矩阵时发挥铆合的作用。这些功能区和结构域在透明带的合成、分必、转运、组装和形成透明带,及其之后的精卵结合、受精卵的保护等方面都有着各自的作用。
精子和卵子的结合是生物学中最重要的相互作用:ZPI作为各透明带单层膜之间的连接,保
持着ZP矩阵结构的完整性;ZP3具有精子结合活性,充当精子的原发受体,结合精子的头部的 ZPBP 和 ZPBP2,诱导顶体反应,发挥着“允许作用”;ZP2 在精子顶体反应中与精子 ZPBP 的二次结合,促进精子穿透透明带;ZP4参与诱导细胞外皮质颗粒中的酶通过修饰透明带蛋白,使得ZP1和ZP3再次合成并形成一层很薄的新的透明带,而防止多精受精。因此,ZP基因突变是一个潜在导致女性不孕的重要原因。
2.与透明带相互作用的精子受体分子
精子与透明带的相互作用非常复杂,透明带的多糖部分可能是精子受体的关键结构,受精后可能因为这些糖基脱落,导致受精卵的透明带不再结合其他精子,人卵透明带的N糖链和O糖链的末梢有丰富的选择素配体特殊结构,因此这些特殊结构可能是人类精卵识别的主要化合物,有待进一步研究证实。目前鉴定出几种存在于精子表面的透明带受体,如甘露糖苷酶、1,4半乳糖基转移酶和透明带外源凝集素等,都有很强的亲和力,能够识别特殊糖残基的凝集素样结构,它们中的每一个分子在识别过程中都起到重要的作用。
3.精子穿过卵丘和透明带
获能的精子能穿过卵丘,然后到达透明带,精子与卵子的 ZP相互作用后,穿过透明带,进入卵周间隙(perivitelline space,PVS),并与卵质膜结合,进而穿入卵质膜。
卵子透明带外面包被着卵丘细胞和基质,共同构成卵丘,在获能精子发生顶体反应时,顶体内的透明质酸酶释放出来,分解卵丘细胞之间的透明质酸等物质,使精子能够穿透卵丘,有机会接触透明带
精子接触透明带后与ZP结合后,精子头以不同的角度向透明带内部穿人。精子-透明带的相互作用主要依赖于酶的作用,精子质膜上的酶,如顶体蛋白酶和半乳糖基转移酶,可以水解 ZP蛋白,这样既可改变ZP的结构,又可提高精卵融合能力。
4.多精受精
多精受精是指受精时有两个或两个以上的精子穿人卵母细胞。生理条件下,多精受精率约为1%。而人类体外受精胚胎移植过程中有高达2%~10%的多精受精卵出现,这些多精受精卵虽然可以发育成胚胎,但最终会导致流产、葡萄胎或多倍体畸形儿的发生。
目前认为阻止多精受精主要依赖透明带反应、皮质反应(cortical reaction,CR)及卵质膜的阻止作用。
正常生理情况下,精子必须在顶体反应的基础上穿过卵细胞膜,在精子穿入卵细胞后,随之发生所谓“皮质反应”,皮质的颗粒包膜逐渐与卵细胞膜融合,而把皮质颗粒和卵细胞皮层的一部分排入卵外间隙,皮质颗粒中的内含物(主要是一些酶类)释放到卵周隙,引起“皮质反应”导致透明带变质硬化,使透明带以外的精子不能再穿人,正在穿人透明带的其他精子被固定在透明带内,以保证只有一个精子进入卵细胞。因此,皮质反应实质是在透明带、卵质膜和卵周隙三个不同层次上阻止多精受精的最初事件。研究表明,卵子质膜下存在由高尔基复合体合成的皮质颗粒(cortical granules,CGs),CGs中含有黏多糖、酸性磷酸酶及组织纤维酶原激活剂(tissue plasminogen activator,PA)、肝素结合胎盘蛋白以及可以使透明带硬化的卵过氧化物酶等。皮质反应过程外吐的CGs内容物存于卵的表面,形成一层皮质颗粒膜,对精子入卵起阻止作用。
透明带(ZP)是覆盖在卵细胞表面的一层糖蛋白外衣,它不仅保护卵母细胞及早期胚胎。还是精卵识别和结合的主要成分。透明带是首要的阻止多精受精的第一道屏障,一旦精子与卵子融合,皮质反应后,CGs 释放到卵周隙中,经 ZP 上的小孔达到ZP 表面,破坏精子受体,透明带结构发生变化,称为透明带反应。此时,卵子浅层细胞质内的皮质颗粒释放内容物到膜周围间隙,这种物质能够破坏或灭活透明带上与精子结合的受体,还能使透明带对顶体蛋白酶的反应减弱,阻止精子穿越透明带。透明带对精子的结合力下降,从而防止多精进入卵母细胞。精卵融合后,CGs胞吐,CGs的膜整合到卵质膜,使卵质膜发生重组,改变了卵质膜表面的物质,这些物质可阻止多精入卵。
导致多条精子进人卵子的原因有以下几方面
①卵子未成熟或过熟;
②精子聚集或浓度过高;
③透明带异常;
④卵泡液中高孕酮和高雄激素水平、精卵孵育条件不当(pH及温度等)。
未成熟卵不能发生完善的皮质反应和透明带反应,过熟的卵母细胞可以正常受精,但他们的发育能力显著降低,精子聚集或浓度过高可致卵母细胞皮质颗粒释放延迟,从而出现较高的多精受精。
卵母细胞内的皮质颗粒(CGs),是卵母细胞特有的参与阻止多精受精的细胞器。其来源于卵母细胞早期生长和发育过程中的皮质胞质,CGs的释放与多精受精有关,具体机制尚不明确。